RESUMEN
La Proteína Verde Fluorescente (Green Fluorescent Protein, GFP) es ampliamente utilizada en ensayos in vivo e in vitro. Se han generado múltiples variantes de esta proteína para diversificar sus características, como la GFP-enhancer (EGFP) que emite una señal de fluorescencia 35 veces mayor en comparación con la proteína silvestre, siendo implementada como proteína fusión en estudios de localización y estabilidad estructural, entre otros. La detección de esta proteína y sus variantes puede ser directa o indirecta, mediante el uso de anticuerpos anti-GFP. Aunque el uso de GFP es generalizado y de evidente utilidad en investigación y en docencia, los insumos para su estudio exhiben un alto costo dado que deben ser importados, constituyendo un recurso limitado en Colombia. El presente trabajo reporta la clonación y expresión de la proteína recombinante 6xHisEGFP, cuya purificación se completó a partir de la fracción soluble e insoluble del sistema heterólogo Escherichia coli mediante cromatografía de afinidad a metales inmovilizados y electroforesis preparativa, respectivamente. La proteína purificada se implementó como antígeno para la producción de anticuerpos policlonales aviares (IgY) contra la EGFP, los cuales se obtuvieron desde los huevos colectados y el suero de las sangrías de las gallinas inmunizadas. En este sentido, la estrategia metodológica planteada constituye un avance en el desarrollo de un sistema biotecnológico para la producción nacional de herramientas moleculares como los anticuerpos policlonales aviares a bajo costo.
Green Fluorescent Protein (GFP) is widely used in in vivo and in vitro assays. Multiple variants of this protein have been generated to diversify its characteristics, such as the enhancer GFP (EGFP) that emits a 35-fold higher fluorescence signal compared to the wild-type protein, being implemented as a fusion reporter in localization and structural stability studies, among others. Detection of this protein can be direct or indirect, fusing anti-GFP antibodies. Although the use of GFP is generalized and of evident utility in research and teaching, the molecular tools for its study exhibit a high cost since they must be imported, constituting a limited resource in Colombia. This work reports the cloning and expression of the recombinant protein 6xHisEGFP, which purification was completed from the soluble and insoluble fraction of the heterologous Escherichia coli system by immobilized metal affinity chromatography and preparative SDS-PAGE, respectively. The purified protein was implemented as an antigen to produce avian polyclonal antibodies (IgY) against EGFP, which were obtained from collected eggs and blood serum from immunized hens. In this sense, the proposed methodological strategy constitutes an advance in the development of a biotechnological system for the national production of molecular tools such as avian polyclonal antibodies at low-cost.
RESUMEN
Resumen Los sistemas de defensa anti-oxidante utilizados por el parásito intracelular Leishmania braziliensis durante el proceso de infección permiten eliminar especies reactivas de oxígeno y nitrógeno a expensas de equivalentes reductores derivados de la tripanotiona, evitando daños celulares del patógeno. Con el objetivo de identificar potenciales blancos moleculares para el desarrollo de fármacos contra este parásito, se realizó la detección de la enzima triparedoxina peroxidasa citoplasmática de L. braziliensis (LbTXNPxII), la cual es esencial para disminuir concentraciones tóxicas de peróxido de hidrógeno en el contexto de infección. Para esto se generaron anticuerpos policlonales en modelo aviar, partiendo de la clonación, expresión y purificación de la proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) en el sistema heterólogo Escherichia coli. La proteína purificada se utilizó como antígeno para la producción de anticuerpos IgY, cuya implementación en estudios in situ permitió detectar y localizar la enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) en el citoplasma de promastigotes fijados y verificar su interacción molecular con la nicotinamida/ nicotinato mononucleótido adenilil transferasa, enzima involucrada en la síntesis del NAD. De este modo, se reporta el desarrollo de una herramienta bioquímica para la identificación y estudio de la enzima LbTXNPxII y su participación en vías del metabolismo energético y de defensa anti-oxidante.
Abstract The antioxidant defense systems used by the intracellular parasite Leishmania braziliensis during the infection process make it possible to eliminate reactive oxygen and nitrogen species at the expense of reducing equivalents derived from trypanothione, avoiding cellular damage of the pathogen. In order to identify potential molecular targets for the development of drugs against this parasite, the cytoplasmic tryparedoxin peroxidase of L. braziliensis (LbTXNPxII), which is essential to reduce toxic concentrations of hydrogen peroxide in the context of infection, was carried out. In this regard, polyclonal antibodies were generated in an avian model, starting from the cloning, expression, and purification of the recombinant protein 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) in the heterologous system of Escherichia coli. The purified protein was used as an antigen for the production of IgY antibodies, whose implementation in in situ experiments allowed the detection and localization of the endogenous LbTXNPxII enzyme (22kDa) in the cytoplasm of fixed promastigotes, as well as the verification of its molecular interaction with nicotinamide/nicotinate mononucleotide adenylyltransferase, an enzyme involved in the synthesis of NAD. Thus, the development of a biochemical tool for the identification and study of the LbTXNPxII enzyme and its participation in energy metabolism and antioxidant defense pathways is reported.
Resumo Os sistemas de defesa antioxidante utilizados pelo parasita intracelular Leishmania braziliensis durante o processo de infecção, permitem a eliminação de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio em detrimento de equivalentes redutores derivados de tripanotiona, evitando o dano celular do patógeno. Com o objetivo de identificar potenciais alvos moleculares para o desenvolvimento de drogas contra esse parasita, foi detectada a enzima citoplasmática triparedoxina peroxidase de L. braziliensis (LbTXNPxII), essencial para reduzir as concentrações tóxicas de peróxido de hidrogênio no contexto de infecção. Para isso, anticorpos policlonais foram gerados em modelo aviário, a partir da clonagem, expressão e purificação da proteína recombinante 6xHis-SUMO-LbTXNPxII (37kDa) no sistema heterólogo de Escherichia coli. A proteína purificada foi utilizada como antígeno para a produção de anticorpos IgY, cuja implementação em experimentos in situ permitiu a detecção e localização da enzima LbTXNPxII endógena (22kDa) no citoplasma de promastigotas fixos e verificar sua interação molecular com nicotinamida/nicotinato mononucleotídeo adenililtransferase, enzima envolvida na síntese de NAD. Assim, é relatado o desenvolvimento de uma ferramenta bioquímica para a identificação e estudo da enzima LbTXNPxII e sua participação no metabolismo energético e nas vias de defesa antioxidante.
